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CRISPR/Cas9 基因敲除原理

CRISPR/Cas9 是一种细菌抵抗噬菌体入侵的免疫机制，在该机制中 Cas9 蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割目标 DNA 的两条链，而 CRISPR 则是一段引导 RNA(gRNA) 负责引导 Cas9 蛋白至目的基因位置处进行切割，从而对目的基因进行编辑。

1/ Cas9 蛋白

常用的 Cas9 蛋白来源于 Streptococcus pyogenes 菌株，由于该蛋白的 PAM 识别序列仅仅只有 2 个碱基(GG)，因此几乎可以在所有的基因中都能找到大量的靶点，因此得到广泛的应用；并且 Cas9 蛋白在几乎所有的生物和细胞中都有活性，包括植物和动物；

2/ saCas9 蛋白

saCas9 是目前自然界中发现的 II 型 CRISPR-Cas 系统中体积较为小巧的 Cas9 蛋白，由 1053 个氨基酸组成。因此，该蛋白便于体内递送，可在多种生物中进行基因组编辑。研究发现，saCas9 结合和切割靶向 DNA 分别需要 6bp 和 18bp 的 PAM 近端 DNA 与 gRNA 互补。这些酶活性是由 DNA 蛋白间两个稳定的互作位点介导的，其中之一位于距 PAM 约 6bp 处，另一个在原始间隔区域内。

因此对于 Cas9 和 saCas9 的选用，需要根据具体实验的需求进行选择，简单的说就是，一般 Cas9 蛋白的基因敲除效率更高，并且靶点的选择性更多。而 saCas9 蛋白的特异性更高，但相对的靶点的选择性也更少。

CRISPR是指 有效编辑有机体内部分基因的技术。目前根据不同的Cas核酸酶来分类一共有三种不同的系统。其中二型的比较简单，是以Cas9核酸酶以及向导RNA（gRNA）为核心组成。

如果要使用CRISPR/Cas9系统对基因组进行编辑，第一步也是最重要的一步，就是要设计gRNA。下面这篇文章就为大家汇总一下gRNA设计常用的方法：

一、首先着重介绍几个在线设计gRNA的工具

• 着重推荐Lei Stanley Qi Lab的 http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp

这个在线站点功能非常丰富，可以选择基因编辑工具的其他用途（激活，抑制基因表达等）（图1-1）。下一步就是选择物种（图1-2）。但只有常见的9种。再下一步就是直接输入基因的名称（或序列）即可（图1-3）。

图1-1 选择编辑类型

图1-2 选择物种

图1-3 选择基因名称。

但是出来的sgRNA位置有一些并不总在ATG的下游（图2所示，1，2，6，9，12，16，22几条sgRNA位于ATG的上游）。所以根据位置，对于做基因的敲除（KO）而言，强烈建议选择ATG下游通常100 aa以内范围内的sgRNA来用（比如图3中的3，5，7，10等较下游的）；而且，一定要位于CCDS区域内（CCDS是consensus CDS，即公共的CDS区域，是针对很多个转录本[isoforms]定义，图2中路色条框即是。这个很重要！！！）。

图2

● Feng Zhang lab：http://crispr.mit.edu/

这是最早的一个设计站点。包括常见的16个物种。选中物种，把你要设计的区段序列扔到下面的框里运行就行。。但前提是你自己已经选好了位置（图3）

图3

• 还有其他，如omictools下面的Cas-Designer http://www.rgenome.net/cas-designer/

这个站点内容更加丰富，比如物种覆盖式最多的，包括植物，昆虫等等（图4左）。这个站点也是输入目的基因的序列定制的，不同的是可以有较大的自由度选择位置预测。

图4

• 还有一些商业公司的，比如Thermo下面的（图5）：

https://apps.thermofisher.com/crispr/index.html#/search

物种较少，商业性目的特别强，了解下即可。

图5

• 其实你只要google一下会发现特别多的设计工具，感兴趣的可以自行探索。

图6

二、手动版设计方法—好用不贵

手动版本虽然费事，但有时候却会事半功倍，节约后续鉴定单克隆的成本。我们举例来说：

图7

序列中PAM和sgRNA的序列放大如下（前提是sgRNA位于CCDS区域，而且特异性要保证）：

图8

也即我常说的，让Cas9切割位置（确定的）跨过一个酶切位点（比如sfcI）（在前两篇文章中都有所提及）。这样， 在Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候，酶切位点一定会遭到破坏。这为后续的单克隆鉴定提供了便利。请看示意图（图9）：

图9

注意一点：PCR引物设计的时候确保PCR片段内部不要出现第二个SfcI的酶切位点。这样后面酶切的时候结果是唯一的。实验流程和鉴定结果应该是这样的（图10）：

↓

图10

对于WT，酶切是充分的，不会残留。而对于成功编辑的两个mixture：*1和*2，由于产生了indels，部分sfcI的位点造到破坏，sfcI切不动的。对于成功编辑的单克隆而言，应该是一点都切不动。后续鉴定只要这样的克隆去测序即可（图11，红色编号为阳性克隆）。

图11

TA克隆结果（图12）：

图12

三、其他Cas9，比如Cpf1和saCas9的设计

因为以上介绍的站点没用涉及Cpf1和saCas9，特别是saCas9（非常适合AAV介导的载体基因编辑）：http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/index.html这个网站兼容几乎所有类型的Cas9设计。

打开页面，输入要编辑区域的基因组序列，然后在PAM类型里选择你需要的Cas9类型，比如spCas9，saCas9以及cpf1等。其他条件默认设置即可，然后点击sunmit即可。非常傻瓜式的操作（图13，14）

在Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候，酶切位点一定会遭到破坏

图13

图14

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