观察与问题
笔者在2023年10月至2024年6月跟随师兄对番茄中某转录因子进行研究，研究过程中笔者提取了模式番茄（Solanum lycopersicum）多个生长阶段中各器官RNA超60组。在使用TIANGEN公司RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）提取番茄花和成熟果实RNA的过程中，笔者发现步骤4（步骤说明书详见文末相关网址）时在吸附RNA的离心柱CR3中会形成凝胶状物质，且延长离心时间后凝胶状物质仍然存在，而在提取番茄根、茎、叶时未出现该情况。笔者在实验时发现延长离心时间无法去除凝胶状物质后，选择直接按照说明书步骤进行后续实验，最后用微量分光光度计（ALLSHENG Nano-400A）对所提取的RNA进行浓度及质量测定，发现RNA浓度仅在10 ng/μL左右，且A260/A280值低于1.8；而同质量叶片、茎样品按照相同方法提取的RNA浓度为1000-2000 ng/μL，且A260/A280值在1.9-2.1。后续对成熟果实和茎中提取的RNA样品测定紫外吸收光谱（图1），发现成熟果实A260/A230值低于1.0，而茎A260/A230值大于2.0。由此，笔者开始关注含多酚多糖植物材料的RNA提取问题，并尝试更换试剂盒、查阅文献及更换其他方法进行实验。
图1 试剂盒法提取成熟果实RNA样品（A）与茎RNA样品（B）紫外吸收光谱
首先，对于上述笔者在提取RNA时所遇到的问题，笔者怀疑是番茄花和果实中的多酚多糖类物质影响了RNA的提取。多糖是一种粘性物质，且溶解性与RNA相似，在提取RNA的过程中易与RNA结合共沉淀，进而在吸附柱内形成凝胶状物质从而堵塞吸附柱。多酚类物质能够被氧化形成醌类化合物，进而与RNA不可逆结合，并产生褐化现象，干扰RNA的提取，使RNA得率与质量降低。
方法更换与尝试
在出现问题后，笔者尝试更换试剂盒进行提取，选择了南京诺唯赞公司的FastPure Plant Total RNA Isolation Kit (Polysaccharides&Polyphenolics-rich)试剂盒（步骤说明书详见文末相关网址）。该试剂盒与上述TIANGEN公司的试剂盒（DP441）均无需酚和氯仿，安全低毒，且相较于DP441提取RNA所需的时间更短，但对于模式番茄成熟果实的RNA提取效果仍达不到笔者理想。
后来，笔者尝试使用Takara公司生产的RNAiso Plus (TRIzol)（步骤说明书详见文末相关网址）对番茄成熟果实RNA进行提取。该方法需准备氯仿与异丙醇，且TRIzol试剂中含有强还原性的β-巯基乙醇（β-ME），虽然安全性相对试剂盒较低，但提取效果较好，对成熟番茄果实提取RNA所得样品浓度约为300 ng/μL，A260/A280值约为1.8，在使用DNase去除基因组DNA后，可以用于后续qPCR。
文献方法
除上述试剂盒与TRIzol试剂之外，笔者在学校实验课程中使用苯酚-氯仿-异戊醇法[1]提取了白菜叶片RNA，最终效果良好，RNA数量质量均可达标（图2）。此方法使用苯酚和氯仿进行细胞裂解，使多酚多糖通过有机相分离，而RNA保留在水相中，使得提取出的RNA样品质量较高，但是也具有操作步骤繁琐、使用了有毒试剂的缺点，特别是处理多糖含量较高的植物材料时可能需要多次提取和纯化，此外试剂可能也需要自己进行准备。
图2 苯酚-氯仿-异戊醇法提取白菜叶片RNA样品紫外吸收光谱（A）与琼脂糖凝胶电泳（B）。B图泳道上方数字代表样品中RNA质量（μg）
另外，也有文献中提及CTAB法，CTAB法是一种常用于提取植物RNA的经典方法，尤其适合处理含有高量多糖和多酚的植物样本。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子表面活性剂，它能够与植物样本中的多糖、多酚等次生代谢物形成复合物，并将其从RNA中分离。CTAB在高盐环境中能够有效去除这些干扰物质，同时保护RNA不被降解。此外，该方法通过选择性沉淀RNA，从而有效分离RNA和其他细胞成分。虽然在针对多酚多糖含量较高的植物材料的RNA提取中CTAB法相较于苯酚-氯仿-异戊醇法更加优秀，但是使用CTAB法进行提取RNA步骤较苯酚-氯仿-异戊醇法更为复杂繁琐，消耗时间长；受植物材料类型和操作者手法影响较大，再现性和稳定性较差；提取效率相对较差；对于一般植物材料而言，试剂盒更加便利，若植物材料中的多酚多糖类物质较少，没有必要特定使用CTAB法，故实验室可能不会特地准备CTAB法所使用的材料和试剂。此外，对于CTAB法或TRIzol所提取出的RNA样品，可再经过LiCl沉淀法进行进一步纯化，LiCl对RNA的选择性沉淀作用更加专一，但需要注意LiCl沉淀法一般用于进一步纯化RNA，而不作为初步提取RNA的方法[2]。
文献最后给出了提取多酚多糖含量较高的植物材料RNA的混合方法，该方法将CTAB法、LiCl沉淀法、TRIzol法和苯酚-氯仿-异戊醇法相结合，得到了相较于上述方法RNA质与量更加良好的样品。但由于结合了多种方法，该混合方法步骤复杂，耗时很长，且使用了多种有毒有害试剂，使用时应当特别小心，且尽可能避免使用此方法。该方法步骤如下[2]：
1. 在15 mL离心管中准备5 mL CTAB提取缓冲液，其成分包括：2%（w/v）CTAB、2% （w/v） PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、25 mM EDTA、2.0 M NaCl、5% β-巯基乙醇（临使用前添加）。将CTAB提取缓冲液预热至65℃。
2. 将液氮中磨碎的细组织粉（200-500 mg磨碎组织）移入预热至65℃的5 mL提取缓冲液中，旋涡混合均匀30 s，充分摇匀。在旋转混合器（或摇床等类似仪器）上室温孵育至少5 min，并以12,000 rpm离心10 min。
3. 将水相转移到一个新的15 mL管中，加入等体积的苯酚-氯仿体积比24:1混合物（CIA）。通过彻底摇动试管进行混合，在旋转混合器上室温孵育至少5 min，并以12,000 rpm的转速离心10 min。收集上清液并重复该步骤一次。
4. 将水相转移到新管中，加入1/4体积的10 M LiCl，倒置混合，在4℃下沉淀过夜(或在-20℃下沉淀4-6 h)。
5. 在4℃下以15,000 rpm (> 20,000 ×g)离心20-30 min，将试管倒扣在纸巾上或移液，倒出并排出所有上清。
6. 将颗粒溶解于1 mL TRIzol中，涡旋振荡。室温下孵育3-5 min。以15,000 rpm离心10 min，将水相转移到1.5 mL离心管中。
7. 加入氯仿0.2 mL，旋摇均匀。在室温下孵育3-5 min，在15,000 rpm (> 20,000 ×g)下离心10 min。
8. 将水相转移到1.5 mL离心管中，加入等体积的CIA或氯仿。通过剧烈摇动混合均匀，室温下在旋转混合器上孵育至少5 min，并在14,000 rpm下离心10 min。若选择用CIA重复此步骤有利于完全除去蛋白质。
9. 将水相转移到1.5 mL离心管中，加入1/2体积的乙醇(异丙醇则加入等体积异丙醇)。通过反转混合均匀。以15,000 rpm离心10 min，小心地弃去上清。
10. 用500 µl 70% （v/v）乙醇漂洗3-5 min。在15,000 rpm下离心1-2 min。小心地弃去上清。重复上述步骤，风干沉淀。
11. 加入50 µl无RNase水，使沉淀完全溶解。
RNA数量质量测定方法
对于提取后的RNA样品，一般采用分光光度计来检测样品纯度和浓度。根据RNA特有的紫外吸收光谱，使用分光光度计测定样品溶液A280、A260与A230，一般认定A260/A280值接近2.0时样品纯度较高，低于2.0且大于1.8时样品中可能含有少量DNA，低于1.8可能是样品中含有蛋白质。此外，一般认定A260/A230值在2.0以上时样品未受到酚、氯仿等有机溶剂的影响。若条件允许，最好直接测定样品在200-300 nm的紫外吸收光谱，纯度较高的RNA样品应在230 nm左右存在波谷，260 nm处存在波峰。当RNA纯度较好时，所测得的OD260×稀释倍数×40 ng/μL=RNA样品浓度。
琼脂糖凝胶电泳可用于测定RNA完整性。由于细胞中rRNA约占总RNA的80%，故完整性较好的植物RNA样品应当在琼脂糖凝胶电泳后可见明亮、清晰的25S rRNA条带和18S rRNA条带，且25S rRNA与18S rRNA比值接近2.5:1。如果RNA发生降解，这些条带会变得模糊，或者条带之间会出现弥散的RNA片段。
除了使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳以外，文献中还使用了基于毛细管电泳的Bioanalyzer对RNA样品进行分析，但这需要专用的仪器、试剂以及相对应的软件，费用较为昂贵。
总结
植物材料中的多酚多糖会影响RNA的提取，包括极大地降低RNA的得率和较为严重的污染，这会使得所提取出的RNA样品无法用于后续实验。一般而言，需要高质量的植物RNA时优先考虑从该植物幼苗叶片中提取，因为植物幼苗叶片多酚多糖含量较低、基因表达量较高。对于大多数含多糖多酚较少的植物叶片、根、茎进行RNA提取时，使用市面常见的试剂盒即可，因为试剂盒较为方便、减少了有毒试剂的使用，且在操作手法较为熟练时，试剂盒也能够应对含有一定量多酚多糖物质的未成熟果实。当多酚多糖物质含量较高以至于在试剂盒吸附柱内形成凝胶时，可考虑使用TRIzol法进行提取，TRIzol法能够在一定程度上减小多酚多糖对RNA提取实验的影响，且TRIzol试剂能够直接购买，但也需要购买氯仿、异戊醇，且试剂毒性相对于试剂盒较高。也可以考虑CTAB法进行提取，但是CTAB法需要自行配置提取缓冲液，步骤相对复杂，耗时较长，受材料和操作影响较大，且现今实验室可能不会特地准备CTAB法所需试剂。当TRIzol法和CTAB法提取的RNA样品数量足够但纯度不够时，可考虑使用LiCl沉淀法进行进一步纯化，但LiCl沉淀法无法用于RNA初步提取。若上述方法所提取的RNA样品均无法达到需求，最后可考虑文献的混合方法，混合方法步骤十分繁琐，提取时间很长，使用了多种有毒试剂，故一般不建议使用。
参考文献
[1] Zhang N, Yu D, Zhu X. RNA Isolation from Plant Tissues: A Hands-on Laboratory Experimental Experience for Undergraduates[J]. Biochem Mol Biol Educ. 2018;46(3):253-261.
[2] Sasi S, Krishnan S, Kodackattumannil P, et al. DNA-free high-quality RNA extraction from 39 difficult-to-extract plant species (representing seasonal tissues and tissue types) of 32 families, and its validation for downstream molecular applications[J]. Plant Methods. 2023;19(1):84. Published 2023 Aug 11.
相关网址
[1]TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）：https://www.tiangen.com/content/details_40_21390.html
[2]南京诺唯赞FastPure Plant Total RNA Isolation Kit (Polysaccharides&Polyphenolics-rich)试剂盒：https://bio.vazyme.com/product/164.html